羅漢果皂苷通過沉默信息調節因子1/核因子E2相關因子2信號通路調控過氧化氫所致視網膜色素上皮細胞氧化應激反應_《中華眼底病雜志》

作者：

牛超 , 崔龍江 , 董道權 ,  李曉華

河南省立眼科醫院眼科激光室, 鄭州 450003;

關鍵詞：

羅漢果皂苷視網膜色素上皮細胞氧化應激活性氧沉默信息調節因子1 核因子E2相關因子2 細胞實驗

DOI：

10.3760/cma.j.cn511434-20211102-00625

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目的觀察并初步探討羅漢果皂苷對過氧化氫（H₂O₂）所致視網膜色素上皮（RPE）細胞氧化應激反應的影響及其可能作用機制。方法實驗研究。將人RPE細胞隨機分為對照組、H₂O₂組、沉默信息調節因子1（SIRT1）抑制劑EX527組（EX527組）、羅漢果皂苷組、羅漢果皂苷+EX527組。噻唑藍比色法檢測各組細胞存活率；流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率；2',7'-二氯雙氫熒光素二乙酸酯探針、黃嘌呤法、酶聯免疫吸附試驗分別檢測細胞中活性氧（ROS）水平、超氧化物歧化酶（SOD）活力和丙二醛（MDA）含量；實時定量聚合酶鏈反應、蛋白免疫印跡法檢測細胞中SIRT1、核因子E2相關因子2（Nrf2）、血紅素氧合酶-1（HO-1）mRNA、蛋白相對表達量。多組間比較采用單因素方差分析；組間兩兩比較采用最小顯著差法t檢驗。結果與對照組比較，H₂O₂組細胞存活率降低，凋亡率升高，細胞中ROS水平升高，SOD活力降低，MDA含量升高，SIRT1、Nrf2、HO-1 mRNA和蛋白相對表達量降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。與H₂O₂組比較，EX527組細胞存活率降低，凋亡率升高，細胞中ROS水平升高，SOD活力降低，MDA含量升高，SIRT1、Nrf2、HO-1 mRNA和蛋白相對表達量降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；羅漢果皂苷組細胞存活率升高，凋亡率降低，細胞中ROS水平降低，SOD活力升高，MDA含量降低，SIRT1、Nrf2、HO-1 mRNA和蛋白相對表達量升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。與羅漢果皂苷組比較，羅漢果皂苷+EX527組細胞存活率降低，凋亡率升高，細胞中ROS水平升高，SOD活力降低，MDA含量升高，SIRT1、Nrf2、HO-1 mRNA和蛋白相對表達量降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。結論羅漢果皂苷可減輕H₂O₂所致RPE細胞氧化應激反應，促進細胞增生，減少細胞凋亡；其可能通過激活SIRT1/Nrf2信號通路發揮抗氧化作用。

引用本文： 牛超, 崔龍江, 董道權, 李曉華. 羅漢果皂苷通過沉默信息調節因子1/核因子E2相關因子2信號通路調控過氧化氫所致視網膜色素上皮細胞氧化應激反應. 中華眼底病雜志, 2023, 39(7): 576-582. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20211102-00625 復制

老年性黃斑變性（AMD）是老年人視力下降和喪失的重要原因之一，主要表現為脈絡膜新生血管生成和視網膜色素上皮（RPE）細胞進行性萎縮^[1]。RPE是視網膜結構的最外層，內含豐富黑色素，可減輕強光對眼組織造成的氧化損傷，在維持光感受器和視網膜完整性方面至關重要^[2]。RPE細胞損傷是AMD早期事件，尤其是活性氧（ROS）過度累積引起的氧化應激損傷，可引起視網膜功能障礙，最終導致視力下降或喪失，減輕ROS對RPE細胞的損傷是延緩AMD進展的有效方法^[3]。研究報道，適當補充抗氧化劑有助于眼健康^[4]。此外，抗氧化劑對RPE細胞的氧化應激損傷具有保護作用^[5]。羅漢果皂苷是羅漢果有效成分之一，具有抗炎、降糖、抗腫瘤等多種藥理活性。研究發現，羅漢果皂苷可減輕妊娠糖尿病大鼠的氧化應激損傷，保護胰腺組織^[6]。鑒于羅漢果皂苷具有抗氧化作用，推測其可能對RPE細胞的氧化應激損傷有積極作用。本研究采用過氧化氫（H₂O₂）誘導RPE細胞氧化損傷，探討羅漢果皂苷對RPE細胞的影響及可能作用機制，旨在為臨床預防和治療AMD提供新的方法和思路。現將結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 主要實驗材料

人RPE細胞株（ARPE-19細胞株，美國ATCC公司）；羅漢果皂苷V（≥98%）（成都曼思特生物科技有限公司）；30% H₂O₂（天津化學試劑一廠）；沉默信息調節因子1（SIRT1）抑制劑EX527、2',7'-二氯雙氫熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）（美國Sigma公司）；膜聯蛋白（Annexin）Ⅴ/碘化丙啶（PI）細胞凋亡檢測試劑盒（南京凱基生物科技發展有限公司）；丙二醛（MDA）酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（美國R&D公司）；超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；兔抗人SIRT1單抗（ab189494）、核因子E2相關因子2（Nrf2）單抗（ab62352）、血紅素氧合酶-1（HO-1）單抗（ab189491）、辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔IgG（ab150077）（美國Abcam公司）；免疫熒光顯微鏡（日本Nikon公司）；全自動酶標儀（美國Bio-RAD公司）；DYCP-31DN電泳儀（北京六一儀器廠）。

1.2 方法

ARPE-19細胞按1×10⁵個/ml的密度接種于96孔板，加入不同濃度羅漢果皂苷（0.000、3.125、6.250、12.500、25.000、50.000 μg/ml），每個濃度設5個復孔。以羅漢果皂苷濃度0時為空白組，培養24 h后，噻唑藍（MTT）比色法檢測細胞吸光度[A，舊稱光密度（OD）]值，計算細胞存活率。

對數增生期ARPE-19細胞按1×10⁵個/ml的密度接種于96孔板，培養24 h后加入不同濃度H₂O₂（0、50、100、200、400、800 μmol/L），每個濃度設5個復孔。以H₂O₂濃度0時為空白組，繼續培養24 h，加入MTT溶液孵育4 h，棄上清，加入二甲基亞砜（150 μl/孔）振蕩10 min，酶標儀測量各孔樣本在波長490 nm處的A值，計算細胞存活率。細胞存活率（%）=各濃度組A值/空白組A值×100%。

根據篩選的H₂O₂和羅漢果皂苷作用濃度，將細胞隨機分為對照組、H₂O₂組、SIRT1抑制劑EX527組（EX527組）^[7]、羅漢果皂苷組、羅漢果皂苷+EX527組。對照組常規培養，不作任何處理；H₂O₂組置于含200 μmol/L H₂O₂的培養基孵育24 h；EX527組、羅漢果皂苷組、羅漢果皂苷+EX527組分別置于10 nmol/L的EX527、6.25 μg/ml羅漢果皂苷、6.25 μg/ml羅漢果皂苷+10 nmol/L的EX527孵育24 h后，再加入含200 μmol/L H₂O₂的培養基孵育24 h。24 h后，MTT法檢測各組細胞A值，計算細胞存活率。

流式細胞儀檢測細胞凋亡率。收集各組細胞，棄培養液，磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗，胰酶消化，收集細胞，以離心半徑8 cm、1 000 r/min離心5 min，PBS重懸，再次離心棄上清，100 μl結合緩沖液重懸細胞，5 μl AnnexinV-FITC避光4℃孵育15 min，10 μl PI染色5 min，加入PBS至500 μl，1 h內采用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。細胞凋亡率=（早期凋亡細胞數+晚期凋亡細胞數）/總細胞數×100%。每組設5個復孔。

DCFH-DA探針檢測細胞中ROS水平。取各組細胞，每孔加入5 μmol/L的DCFH-DA 200 μl，37℃、5% CO₂培養箱靜置30 min，PBS洗滌，流式細胞儀檢測ROS水平。

黃嘌呤法檢測細胞中SOD活力。取各組細胞，以離心半徑12 cm、12 000 r/min離心5 min，取上清，二喹啉甲酸（BCA）法測定樣品蛋白濃度。96孔板中加入待測樣品、緩沖液、工作液，37℃、5% CO₂培養箱孵育30 min，酶標儀測量各孔樣品在波長450 nm處的A值，計算待測樣品SOD活力。

ELISA檢測細胞中MDA含量。取各組細胞，以離心半徑8 cm、2 000 r/min離心5 min，取上清，在酶標包被板孔依次加樣，加入酶標抗體，洗滌，顯色，終止反應，酶標儀測量樣品在波長450 nm處的A值，計算待測樣品MDA含量。

實時定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測細胞中SIRT1、Nrf2、HO-1 mRNA相對表達量。收集各組細胞，Trizol法提取總RNA，檢測RNA濃度和純度，逆轉錄合成cDNA。反應體系包括cDNA 1 μl，正向引物及反向引物各1 μl，2倍SYBR? Green PCR Master Mix 6 μl，雙蒸水11 μl。所用引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表1）。反應條件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，共40個循環。以β-肌動蛋白（actin）為內參基因，采用2^?△△CT法計算目的基因相對表達水平。

表1 基因擴增和測序引物

表選項

下載CSV

檢測因子	正向引物（5’→3’）	反向引物（5’→3’）	擴增片段長度（bp）
SIRT1	TGCAGAGCATACGTGTACGAT	ACAGGACGCTGCCGTTCAGGT	76
Nrf2	ACAAGTCAGTACCTGCATAT	CGTCAGTACATACTGTCAGT	137
HO-1	GCTGACTTACATGCAGTGATCG	ACGTCTGACAGATCACGTAGAG	158
β-actin	ATCGCTAGAGCTAGGTGATAC	CATCACGAGTAGTAGCATTCT	89
注：SIRT1：沉默信息調節因子1；Nrf2：核因子E2相關因子2；HO-1：血紅素氧合酶；actin：肌動蛋白

蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測細胞中SIRT1、Nrf2、HO-1蛋白相對表達量。收集各組細胞，PBS洗滌，加入RIPA冰上裂解15 min，以離心半徑10 cm、12 000 r/min 4℃離心10 min，收集上清，BCA法蛋白定量。沸水浴蛋白變性，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳中上樣電泳，轉至聚偏氟乙烯膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入SIRT1（1∶500）、Nrf2（1∶500）、HO-1（1∶500）、β-actin（1∶800）一抗，4 ℃孵育過夜，洗膜緩沖液（TBST）洗膜，加入HRP標記的山羊抗兔IgG（1∶2 000），室溫孵育2 h，TBST洗膜，加入化學發光底物進行曝光并拍照，凝膠成像系統掃描分析蛋白條帶。目的蛋白相對表達水平=目的蛋白條帶灰度值/內參照β-actin蛋白條帶灰度值。

1.3 統計學分析

采用SPSS25.0軟件行統計學分析。符合正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析；組間兩兩比較采用最小顯著差法t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度H₂O₂對ARPE-19細胞存活率的影響

與空白組（0 μmol/L）比較，不同濃度H₂O₂均可抑制ARPE-19細胞增生，差異有統計學意義（P＜0.05）；隨H₂O₂濃度增加，細胞存活率呈下降趨勢，差異有統計學意義（P＜0.05）（圖1）。H₂O₂濃度為200 μmol/L時，細胞存活率為（51.24±2.84）%，后續實驗選取H₂O₂濃度為200 μmol/L。

圖1 不同濃度H₂O₂干預后ARPE-19細胞存活率變化（n=5）　H₂O₂：過氧化氫；^a與空白組比較，P＜0.05；^b與50 μmol/L比較，P＜0.05；^c與100 μmol/L比較，P＜0.05；^d與200 μmol/L比較，P＜0.05；^e與400 μmol/L比較，P＜0.05

圖選項

組別	n	吸光度值	細胞存活率（%）
對照組	5	1.21±0.03	100.00±0.00
H₂O₂組	5	0.62±0.02^a	51.24±2.76^a
EX527組	5	0.41±0.02^ab	33.88±2.24^ab
羅漢果皂苷組	5	1.05±0.03^abc	86.78±3.35^abc
羅漢果皂苷+EX527組	5	0.86±0.02^abcd	71.07±3.21^abcd
F值		862.917	517.651
P值		＜0.001	＜0.001
注：H₂O₂：過氧化氫；^a與對照組比較，P＜0.05；^b與H₂O₂組比較，P＜0.05；^c與EX527組比較，P＜0.05；^d與羅漢果皂苷組比較，P＜0.05

組別	n	SOD（U/mg·pro）	MDA（nmol/ml）
對照組	5	28.26±2.53	6.38±1.08
H₂O₂組	5	11.35±1.26^a	13.59±1.37^a
EX527組	5	8.28±1.09^ab	16.85±1.42^ab
羅漢果皂苷組	5	23.25±1.89^abc	8.26±1.13^abc
羅漢果皂苷+EX527組	5	18.46±1.53^abcd	10.27±1.25^abcd
F值		112.541	55.616
P值		＜0.001	＜0.001
注：H₂O₂：過氧化氫；SOD：超氧化物歧化酶；MDA：丙二醛；^a與對照組比較，P＜0.05；^b與H₂O₂組比較，P＜0.05；^c與EX527組比較，P＜0.05；^d與羅漢果皂苷組比較，P＜0.05

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羅漢果皂苷通過沉默信息調節因子1/核因子E2相關因子2信號通路調控過氧化氫所致視網膜色素上皮細胞氧化應激反應

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