遺傳性視網膜疾病（IRD）是臨床上難治性致盲眼病，基因替代療法在IRD的治療中已經取得了初步的進展。對于難以通過基因替代療法進行治療的IRD，基因編輯技術提供了一種新的治療思路。針對IRD不同的遺傳模式和致病變異類型，可以通過破壞致病變異基因配合或不配合野生型基因的補充治療、精確修復致病變異基因等策略以達到治療疾病的目的。CRISPR/Cas9基因編輯技術及以此為基礎的堿基編輯技術和先導編輯技術在視網膜色素變性、Usher綜合征、Leber先天性黑矇、錐桿細胞營養不良等疾病動物模型體內實現了致病變異基因的編輯，在IRD的基因編輯治療中展現了良好的應用前景。
引用本文： 佘凱芩, 陳沁, 陸方. 基于CRISPR/Cas9的基因編輯技術在遺傳性視網膜疾病治療中的研究進展. 中華眼底病雜志, 2023, 39(7): 605-610. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20220908-00493 復制
遺傳性視網膜疾病（IRD）是一組具有高度異質性的疾病，可造成不可逆的視力損傷，以光感受器和（或）視網膜色素上皮（RPE）細胞的退化為特征，有至少277個核基因和數個線粒體基因與其相關[1]。過去十年中，雖然基因替代療法在IRD的治療中已取得初步進展[2-3]，但仍然無法滿足所有IRD的治療[4-5]。CRISPR/Cas系統是目前為止最新且應用最為廣泛的基因編輯工具，隨著該系統和相關技術的出現以及病毒遞送系統的日漸成熟，為從基因上修復IRD的致病變異來治療疾病提供了理論可行性。現就傳統CRISPR/Cas9基因編輯技術以及基于此的堿基編輯技術和先導編輯技術在IRD治療研究中的進展作一綜述，主要著重于基因編輯的不同策略，以供讀者深入了解IRD基因編輯治療的原理。
1 CRISPR/Cas9基因編輯技術
CRISPR/Cas系統是一種廣泛存在于細菌和古生菌的獲得性免疫系統，可識別入侵的病毒并造成病毒DNA雙鏈的斷裂[6]。自2012年CRISPR/Cas9的體外重構和2013年首次在人體細胞中證明了其基因編輯功能以來，對CRISPR/Cas系統的探索、改造及應用的研究層出不窮[6-7]，其中最常用于DNA編輯的是Ⅱ型Cas9系統。優化后的Cas9系統包括Cas9蛋白和sgRNA，Cas9蛋白與目標基因中的前間隔序列鄰近基序（PAM）序列相結合，sgRNA識別PAM序列5’端前序序列，隨后Cas9蛋白在PAM序列上游3個堿基處形成雙鏈斷裂。最早發現和最廣泛使用的是釀膿鏈球菌Cas9（SpCas9），隨后還發現了金黃色葡萄球菌Cas9（SaCas9）、空腸彎曲菌Cas9等，這些不同種類的Cas9蛋白，具有不同分子大小、PAM序列、sgRNA結構、最佳的前序序列長度、基因編輯效率和特異性。例如，SpCas9蛋白包含1 368個氨基酸，PAM序列為NGG，最佳的前序序列長度為20 nt，基因編輯效率較高，同時脫靶效應較顯著。而其他Cas9相對SpCas9可能存在某些方面的優勢，例如SaCas9較SpCas9更小，包含1 053個氨基酸，更適合包裝到腺相關病毒（AAV）中[8]。另外，研究者們還對天然的Cas9蛋白進行結構的優化或改造得到了各種Cas9的變體，改變其PAM序列以擴大靶向基因的范圍，例如SpCas9-EQR、VQR、VRER分別識別NGAG、NGA、NGCG三種PAM序列[9]，SpCas9-NG識別NG[10]；或提高DNA編輯的特異性，降低其脫靶效應，例如SpCas9-HF1[9]。
DNA雙鏈斷裂發生后，真核細胞內存在兩種DNA修復機制：非同源末端連接（NHEJ）和同源重組（HDR）[11]。NHEJ可以將斷裂的DNA雙鏈連接起來，但同時會在斷裂點引入核酸的插入或刪除（indels）；HDR可在DNA模板的指導下進行精確的修復。NHEJ在大多數哺乳動物細胞中高效的發生，而HDR僅在分裂細胞中較為活躍[12-13]。在包括視網膜細胞在內的分化末期的細胞中，DNA雙鏈斷裂更容易引起indels的發生，而精準修復的概率較低。
2 堿基編輯及先導編輯
雖然CRISPR/Cas9可在HDR模板的存在下通過HDR機制對基因進行精準修復，但是該途徑不僅效率低，同時還不可避免NHEJ導致的indels的產生[14]。為了提高對基因組進行精準修復的效率，David Liu團隊基于Cas9分別于2016年和2019年開發了堿基編輯器（BE）和先導編輯器（PE）[15-16]。
BE是將CRISPR/Cas9蛋白與脫氨酶融合，可在不形成DNA雙鏈斷裂、不依賴HDR的情況下實現堿基的高效且精確的轉化，目前有將靶位點的C·G變為T·A的胞嘧啶堿基編輯器（CBE）和將A·T變為G·C的腺嘌呤堿基編輯器（ABE）兩種[17]。通過這兩種編輯器，可以實現嘌呤與嘌呤之間、嘧啶與嘧啶之間的堿基顛換，包括G→A，A→G，T→C和C→T。但是，這種顛換存在活性窗口，這就要求靶點必須位于活性窗口內，才能實現高效的編輯，但同時如果窗口內還存在其他同樣的堿基，就會造成非目的編輯[18-19]。
PE是基于CRISPR/Cas9的新基因編輯器，同樣不形成DNA雙鏈斷裂，不需要HDR模板，可以實現12種堿基替換，小片段的indels[16]。以PE2為例，該系統包括改造后的反轉錄酶，Cas9切口酶和pegRNA。pegRNA的5’端為sgRNA結構，3’端為一段與切開的DNA的3’端相結合的序列（PBS），在sgRNA和PBS之間是逆轉錄模板，包含目的DNA改變和一段與靶點同源的序列。一旦結合到靶點處，Cas9切口酶在包含PAM序列的DNA單鏈上形成切口，PE使DNA從斷端的3’端開始以pegRNA中的逆轉錄模板為模板進行逆轉錄，逆轉錄結束后，新合成的編輯后的DNA作為3’游離端與DNA切開后未編輯的5’游離端形成競爭關系，而細胞的修復機制會傾向于切除5’游離端，使編輯后的3’端與未編輯的對側鏈形成異源DNA雙鏈。DNA修復機制若以編輯后的DNA鏈為模板將未編輯鏈進行修復，最終就能實現DNA編輯。而在PE2的基礎上增加一個靶向未編輯鏈的sgRNA，與PE2已有的Cas9切口酶一起可以在未編輯鏈上做一個切口，但這個切口相距第一個切口需要一定的距離以避免產生雙鏈斷裂，能促使DNA的修復機制偏向于以編輯后的DNA鏈為模板進行修復，提高DNA編輯的效率，這個系統被命名為PE3。通過對逆轉錄模板的設計，來實現堿基替換、堿基插入和缺失。隨后，Nelson等[20]發現pegRNA 3’端的降解會降低PE的編輯效率，在3’端增加一段結構RNA序列可以增強pegRNA的穩定性，并將其命名為epegRNA。在細胞內，epegRNA能使PE的編輯效率提高3～4倍。Chen等[21]發現，在PE對DNA進行編輯的過程中，DNA錯配修復（MMR）會阻礙PE的編輯，并且導致indels的出現。他們分別在PE2和PE3的基礎上短暫表達MMR抑制蛋白，得到PE4和PE5，使得編輯效率分別提高了7.7倍和2.0倍，同時在MMR較強的細胞中將目的編輯/indels比例提高了3.4倍。另外，他們優化了PE2蛋白，包括使用人源密碼子優化的反轉錄酶、優化的核定位序列以及包含R221K和N394K變異的SpCas9，得到的結構命名為PEmax。PEmax在HeLa細胞中能使編輯效率平均提高2.8倍。
3 CRISPR相關技術用于IRD治療的不同策略
針對IRD不同的遺傳類型和致病機制，可以采用不同的基因編輯手段來達到治療疾病的目的。隱性遺傳的疾病若不適宜采用基因替代療法治療，如致病基因過大不易包裝[22]、過量表達會產生毒性等，就可以通過基因編輯來治療。一旦精準修復基因使得部分野生型蛋白能夠表達發揮其生理作用，就能部分恢復視功能[23]。而當致病變異位于非編碼區時，比如CEP290的內含子變異（c.2991+1655A>G（IVS26）（p.Cys998X）會導致CEP290蛋白表達減少，也可通過破壞變異位點來發揮治療作用[24]。
對于顯性致病變異所致的IRD，采用的策略可分為三種：（1）將等位基因破壞后，配合野生型基因的補充治療；（2）特異破壞變異基因，配合或不配合野生型基因的補充治療；（3）精準修復變異基因。
破壞雙等位基因后進行基因補充治療可以說是最直接的方式。基因破壞可通過CRISPR的NHEJ機制實現，這是一種非精確的基因編輯方式，可在DNA雙鏈斷裂處產生indels，通常會造成移碼突變，使得蛋白表達降低，或者穩定性下降[25]。也可以針對一段序列設計兩個sgRNA，實現對兩個sgRNA中間序列的刪除，相比一個sgRNA，不僅編輯效率更高，而且編輯產物更加可控[26-27]。在雙等位基因同時被破壞后，突變蛋白和野生型蛋白的表達都會降低，同時補充外源的野生型基因可以改善疾病表型[27]。
特異破壞變異基因需要CRISPR系統對變異基因序列有較高的特異性。變異基因需具有不存在于野生型基因中的獨特的PAM序列，或者sgRNA序列。變異基因中存在獨特的PAM序列雖然可高效地分辨變異序列和野生型序列[28]，但變異恰好位于PAM序列的情況較少。變異基因存在獨特sgRNA的情況稍常見，不過SpCas9區別僅有單個堿基不同的前序序列的效率不高，有報道可以通過截短的sgRNA來提高識別效率，如Li等[29]在RHOP23H小鼠模型中使用SpCas9-VRQR和截短的只有17 nt的sgRNA特異靶向變異序列，編輯效率達到（44.8±4.8）%，同時對野生型序列僅有（1.3±0.3）%的編輯效率。
精準修復基因變異可以通過CRISPR的HDR機制，但是HDR的效率比NHEJ低，且通常僅在有絲分裂的細胞中活性較高。而光感受器和RPE都是分化終期的細胞，HDR的效率極低，如Jo等[30]對RPE65基因點突變的rd12小鼠通過HDR機制修復點突變，最終在RPE細胞中修復的效率僅為1.17%，而由于同時存在的NHEJ使得indels的發生率高達20%。Suzuki等[31]提出一種可以不依賴HDR機制的定點整合，可以通過NHEJ機制實現DNA序列的整合，使得MERTK基因在mRNA水平上恢復到正常的4.5%，高于HDR的效率。而BE本身就是作為一種精準修復堿基的工具被提出，可以進行四種堿基顛換，在人和小鼠細胞系中可以達到約15%～75%的修復效率[15]。通過AAV系統遞送到野生型小鼠視網膜下腔，CBE對視桿細胞中單堿基的修復效率為19%，ABE的效率為26%[32]。同時發現ABE幾乎不產生indels，而CBE會產生高達34%的indels。Suh等[33]使用慢病毒遞送ABE至rd12小鼠模型，對RPE細胞中點突變的精準修復效率為16%，僅發生約0.5%的indels，但同時還存在編輯窗口內非靶位點的編輯。在6個最常見的長編碼區（超過單AAV的包裝限制）的隱性致病基因中，包括ABCA4、CDH23、CEP290、EYS、MYO7A、USH2A，對患者的致病變異位點進行分析發現，其中53%的致病變異可以通過BE進行編輯，76%的患者中至少存在一條可以被BE修復的等位基因[22]。PE是另一種可進行基因精準修復的工具，除了能實現所有類型的堿基互換，還能針對小片段插入或者缺失致病的疾病，幾乎覆蓋了大部分的變異類型。Jang等[34]采用視網膜下注射雙AAV遞送PE2系統至rd12小鼠，對RPE中點突變的精準修復效率為6.4%，同時未檢測到其他包括indels在內的非目標編輯，證實了PE系統的安全性。跟CRISPR的機制相比，PE2效率更高；跟ABE相比，PE造成的非靶向編輯更少，更加安全。
在以上三種策略中，特異針對變異位點策略，包括特異破壞變異基因或精準修復變異基因，都需要根據不同的變異位點進行專門的設計，使得這種方式更加個體化。而無差別破壞變異和野生型基因后導入外源性野生型基因，則不需要根據變異位點進行專門的設計，可以更廣泛地適用于某個基因變異的情況。
除了直接對致病基因進行修復外，CRISPR/Cas9還用于編輯其他相關基因，比如NRL、NR2E3基因。在典型的視網膜色素變性（RP）患者中，首先出現由于視桿細胞丟失導致的夜盲，視錐細胞繼發性死亡隨之發生，導致視力的惡化最終失明。因此在RP的治療中，視錐細胞功能的保留是主要目標。NRL、NR2E3基因在視桿細胞的發育和維持中起關鍵作用[35-36]。Yu等[25]在三種視桿細胞特異的基因變異導致的視網膜萎縮小鼠模型中，采用AAV遞送的CRISPR/Cas系統敲除視桿細胞的NRL基因，能使視桿細胞視錐化，有助于光感受器細胞的存活和視錐細胞功能的保存。Zhu等[37]則采用CRISPR/Cas系統同時敲除小鼠的NRL和NR2E3基因，實現更顯著的光感受器細胞的保存和視功能的重建。
4 CRISPR/Cas9及其相關技術在IRD治療的體內應用進展
4.1 RP
RP是一種以進行性視網膜萎縮為特點的疾病，是最主要的致盲性遺傳性眼病，發病率約為1/4 000[38]。到目前為止有約70個致病基因被發現，遺傳方式包括常染色體顯性遺傳（15%～25%）、常染色體隱性遺傳（5%～20%）、X-連鎖遺傳（5%～15%）和未知遺傳方式（40%～50%）[39]。
RHO基因變異占到常染色體顯性遺傳RP的20%～30%，到目前為止約有220多種變異被報道[40]。Latella等[26]在體外和小鼠體內驗證了SpCas9與單、雙sgRNA對RHO基因的敲除效率。其發現，在敲入RHOP23H變異基因的Hela細胞中，單sgRNA對基因的敲除效率為70%～76%，雙sgRNA的效率較高為82%。隨后，該團隊對人源RHOP23H基因敲入的RHO-/-小鼠（RHO-/-P23HTg）進行視網膜下注射Cas9、雙sgRNA和綠色熒光蛋白（GFP）質粒，隨后電轉，在GFP陽性細胞中RHOP23H基因的敲除率為4%～33%。Tsai等[27]則采用基因敲除與基因替代療法相結合的策略，在使用雙sgRNA敲除變異的RHO基因同時補充外源RHO基因。該策略在野生型小鼠中使RHO mRNA水平下降了25%，在RHOP23H或RHOD190N人源變異敲入小鼠模型中能夠明顯改善視網膜外核層厚度、光感受器細胞外節長度以及視網膜電圖反應。Editas公司也采用此策略來治療RHO變異導致的常染色體顯性RP。
也有特異針對RHO變異基因進行敲除的研究，Bakondi等[28]在RHOS334變異的大鼠模型中，根據僅存在于變異等位基因中的PAM序列設計了特異針對變異基因的sgRNA，對變異基因的敲除比例為33%～36%，而對野生型基因沒有影響，減緩了光感受器的退化，改善了大鼠視力。導致常染色體顯性RP最常見的變異是RHO p.Pro23His，Burnight等[41]首先在患者來源的存在RHOP23H變異的誘導多能干細胞（iPSC）中驗證了SaCas9和20 nt或17 nt的sgRNA對變異序列的編輯效率是對僅存一個堿基差異的野生型序列的19倍或22倍，隨后在RHOP23H人源化豬模型中檢測AAV遞送SaCas9以及17 nt的sgRNA的基因編輯效率，2/5只治療后的豬視網膜檢測到3.4%～4.4%的NHEJ的發生。Li等[29]和Giannelli等[42]在RHOP23H人源化小鼠模型中驗證了特異sgRNA對變異基因的靶向性，使用截短的sgRNA或SpCas9變體可以提高對變異基因的靶向性，在對野生型基因沒有或者僅有很低indels產生的情況下，特異敲除P23H變異基因，顯著減緩了光感受器的凋亡和挽救視網膜功能。
NR2E3表達一種光感受器特異性轉錄因子，目前發現的NR2E3與常染色體顯性RP相關的變異只有p.Gly56Arg變異，并且此變異是導致常染色體顯性RP第二常見的變異[43]。Diakatou等[44]針對變異的序列設計的sgRNA能特異性靶向變異的等位基因，將sgRNA和Cas9遞送至存在NR2E3 p. Gly56Arg變異的患者來源的iPSC中，在變異位點附近實現了一個或兩個堿基的插入或缺失，實現了變異的等位基因的特異敲除。
4.2 Usher綜合征
Usher綜合征是一種常染色體隱性遺傳的以感音神經性耳聾和RP為特點的疾病。USH2A是其最常見的致病基因，但是由于其編碼區有近15 kb，使用基因替代療法會有一些困難，同時在視網膜中存在多個USH2A基因編碼的異構體的表達，僅遞送單種異構體可能不夠。而基于CRISPR/Cas9技術的基因編輯技術則能直接對變異的基因進行修復。Fuster-García等[45]采用sgRNA、Cas9和ssODN在帶有USH2A c.2299delG或c2276G>T純合變異的患者的皮膚成纖維細胞中分別達到了5.0%或2.5%的精準編輯的效率。在Usher綜合征第三型中，常見的致病基因是CLRN1，Panagiotopoulos等[46]在沙特阿拉伯人群中新發現了CLRN1基因的內含子變異（c.254-649T>G），這個剪接位點變異會導致一個新的外顯子的出現，因此他們在變異的兩側分別設計了sgRNA，在人RPE細胞系中證實敲除的比例約30%。
4.3 Leber先天性黑矇（LCA）
LCA是最嚴重的遺傳性視網膜疾病之一，其發病時間早，且患者視力損害嚴重。全球發病率約為1/30 000，占所有IRD的5%[47-48]。LCA具有高度遺傳異質性，到目前為止有28個致病基因，超過400種致病變異，大多數為常染色體隱性遺傳[49]。其中，最常見的致病基因包括AIPL1、CEP290、RDH12、GUCY2D、CRB1、RPE65和RPGRIP1[49]。
CEP290變異（LCA10型）占到了所有LCA的15%～20%，是常染色體隱性變異，在歐洲和美國，內含子變異c.2991+1655A＞G（p.Cys998X）是其中的主要致病變異類型，又稱IVS26變異，占55%～77%[50]。此變異可產生新的剪接供體位點，會在約一半的轉錄本中導致引入一段新的外顯子，而這段外顯子中存在提前出現的終止密碼子，使得CEP290蛋白截短，這使存在IVS26變異的患者體內僅部分CEP290有活性。Ruan等[23]首先在構建的存在CEP290 IVS26剪接變異的293FT模型細胞中驗證SpCas9和雙sgRNA可實現對包含變異位點的內含子片段的刪除，增加全長CEP290蛋白的表達；隨后由于疾病動物模型的缺乏，在野生型小鼠中采用雙AAV系統同時遞送SpCas9和雙sgRNA，視網膜下注射后4周檢測視網膜基因組中截短DNA的比例達到7.5%～26.4%。Ledford[51]采用比SpCas9更小的SaCas9與成對sgRNA包裝到單AAV中，首先在體外，包括LCA10型患者的成纖維細胞和人捐獻視網膜植片，篩選并驗證sgRNA位點；隨后在敲入人CEP290 IVS26變異的小鼠模型以及野生型獼猴中證實有效基因編輯效率分別可達21%和28%[24]。這款產品被名命為Edit-101，并于2018年底獲美國食品和藥品管理局批準進行臨床試驗（NCT03872479），并于2020年宣布完成了第一例患者給藥，這是全球首項體內基因編輯CRISPR臨床試驗。
RPE65基因變異（LCA2型）雖然已經有基因替代治療的藥物上市，但是對于接受治療的患者的長期隨訪結果顯示，基因替代治療藥物并不能延緩患者視網膜萎縮的進程，并且對于視功能的改善作用呈現一個上升后下降的趨勢[52-53]。這些結果促使學界仍在做進一步的研究。rd12小鼠是RPE65基因自發點突變產生的LCA 2型的動物模型，Jo等[30]利用HDR對rd12小鼠的變異基因進行修復，雖然在RPE細胞中修復的效率較低為1.17%，但治療小鼠的視網膜功能仍能部分恢復。而用ABE對rd12小鼠進行基因修復，在RPE細胞中對致病變異的修復效率為16%，恢復了部分RPE65蛋白的表達，保存了視錐細胞，使治療小鼠存在近乎正常的視功能[33, 54]。
4.4 錐桿細胞營養不良（CORD）
GUCY2D基因編碼蛋白retGC1，其致病變異在常染色體顯性CORD患者中占到35%[55]。McCullough等[56]分別針對小鼠和獼猴的基因進行sgRNA設計，通過視網膜下注射AAV5遞送SaCas9和sgRNA，基因編輯效率在小鼠體內高到81%，在獼猴體內達到10%～20%，并且顯著降低retGC1蛋白的表達，證實了可能通過對GUCY2D敲除并補充外源性野生型蛋白來實現對GUCY2D常染色體顯性致病變異導致的CORD進行治療。
5 CRISPR/Cas9及其相關技術的安全性
CRISPR/Cas9及其相關技術目前最令人擔憂的安全性問題是其脫靶效應。脫靶會造成非預期的基因產生替換、缺失、插入、顛倒和易位等變異，進而造成遠期的生物學影響[57]，是制約其臨床應用的關鍵問題。CRISPR/Cas9的特異性取決于sgRNA靶向序列的特異性與Cas9本身的保真度。研究者通過提高sgRNA設計的特異性、工程化改造Cas9蛋白等方法來降低CRISPR/Cas9的脫靶效應[58]。人們發現CBE會引起大量全基因組的脫靶，CBE和ABE會引起RNA水平的脫靶[59-60]。這些脫靶效應與sgRNA無關，主要是由脫氨酶引起，需要通過優化脫氨酶以降低脫靶效應。與CRISPR/Cas9和BE相比，PE引起的脫靶效應更低[16, 61]。然而，目前人們對脫靶效應的認識很大程度上依賴于現有的脫靶檢測方法[58]。
6 小結
目前已有很多研究利用CRISPR/Cas9對致病基因進行了糾正并能改善疾病表現，但技術還在不斷的發展以提高基因編輯的效率，減少脫靶效應以提高其安全性。另外大部分的基因編輯工具超過了AAV的載量，研究者們還在致力于探索新的高效的遞送方法或遞送工具，例如用雙AAV遞送或者載量更大的慢病毒。CRISPR/Cas9及其相關技術由于其應用的便捷，正在被大量研究，各種技術瓶頸也在逐漸被突破，對于IRD這種目前沒有有效治療方法的疾病而言，CRISPR/Cas9及其相關技術是一項極具前景的治療手段。
遺傳性視網膜疾病（IRD）是一組具有高度異質性的疾病，可造成不可逆的視力損傷，以光感受器和（或）視網膜色素上皮（RPE）細胞的退化為特征，有至少277個核基因和數個線粒體基因與其相關[1]。過去十年中，雖然基因替代療法在IRD的治療中已取得初步進展[2-3]，但仍然無法滿足所有IRD的治療[4-5]。CRISPR/Cas系統是目前為止最新且應用最為廣泛的基因編輯工具，隨著該系統和相關技術的出現以及病毒遞送系統的日漸成熟，為從基因上修復IRD的致病變異來治療疾病提供了理論可行性。現就傳統CRISPR/Cas9基因編輯技術以及基于此的堿基編輯技術和先導編輯技術在IRD治療研究中的進展作一綜述，主要著重于基因編輯的不同策略，以供讀者深入了解IRD基因編輯治療的原理。
1 CRISPR/Cas9基因編輯技術
CRISPR/Cas系統是一種廣泛存在于細菌和古生菌的獲得性免疫系統，可識別入侵的病毒并造成病毒DNA雙鏈的斷裂[6]。自2012年CRISPR/Cas9的體外重構和2013年首次在人體細胞中證明了其基因編輯功能以來，對CRISPR/Cas系統的探索、改造及應用的研究層出不窮[6-7]，其中最常用于DNA編輯的是Ⅱ型Cas9系統。優化后的Cas9系統包括Cas9蛋白和sgRNA，Cas9蛋白與目標基因中的前間隔序列鄰近基序（PAM）序列相結合，sgRNA識別PAM序列5’端前序序列，隨后Cas9蛋白在PAM序列上游3個堿基處形成雙鏈斷裂。最早發現和最廣泛使用的是釀膿鏈球菌Cas9（SpCas9），隨后還發現了金黃色葡萄球菌Cas9（SaCas9）、空腸彎曲菌Cas9等，這些不同種類的Cas9蛋白，具有不同分子大小、PAM序列、sgRNA結構、最佳的前序序列長度、基因編輯效率和特異性。例如，SpCas9蛋白包含1 368個氨基酸，PAM序列為NGG，最佳的前序序列長度為20 nt，基因編輯效率較高，同時脫靶效應較顯著。而其他Cas9相對SpCas9可能存在某些方面的優勢，例如SaCas9較SpCas9更小，包含1 053個氨基酸，更適合包裝到腺相關病毒（AAV）中[8]。另外，研究者們還對天然的Cas9蛋白進行結構的優化或改造得到了各種Cas9的變體，改變其PAM序列以擴大靶向基因的范圍，例如SpCas9-EQR、VQR、VRER分別識別NGAG、NGA、NGCG三種PAM序列[9]，SpCas9-NG識別NG[10]；或提高DNA編輯的特異性，降低其脫靶效應，例如SpCas9-HF1[9]。
DNA雙鏈斷裂發生后，真核細胞內存在兩種DNA修復機制：非同源末端連接（NHEJ）和同源重組（HDR）[11]。NHEJ可以將斷裂的DNA雙鏈連接起來，但同時會在斷裂點引入核酸的插入或刪除（indels）；HDR可在DNA模板的指導下進行精確的修復。NHEJ在大多數哺乳動物細胞中高效的發生，而HDR僅在分裂細胞中較為活躍[12-13]。在包括視網膜細胞在內的分化末期的細胞中，DNA雙鏈斷裂更容易引起indels的發生，而精準修復的概率較低。
2 堿基編輯及先導編輯
雖然CRISPR/Cas9可在HDR模板的存在下通過HDR機制對基因進行精準修復，但是該途徑不僅效率低，同時還不可避免NHEJ導致的indels的產生[14]。為了提高對基因組進行精準修復的效率，David Liu團隊基于Cas9分別于2016年和2019年開發了堿基編輯器（BE）和先導編輯器（PE）[15-16]。
BE是將CRISPR/Cas9蛋白與脫氨酶融合，可在不形成DNA雙鏈斷裂、不依賴HDR的情況下實現堿基的高效且精確的轉化，目前有將靶位點的C·G變為T·A的胞嘧啶堿基編輯器（CBE）和將A·T變為G·C的腺嘌呤堿基編輯器（ABE）兩種[17]。通過這兩種編輯器，可以實現嘌呤與嘌呤之間、嘧啶與嘧啶之間的堿基顛換，包括G→A，A→G，T→C和C→T。但是，這種顛換存在活性窗口，這就要求靶點必須位于活性窗口內，才能實現高效的編輯，但同時如果窗口內還存在其他同樣的堿基，就會造成非目的編輯[18-19]。
PE是基于CRISPR/Cas9的新基因編輯器，同樣不形成DNA雙鏈斷裂，不需要HDR模板，可以實現12種堿基替換，小片段的indels[16]。以PE2為例，該系統包括改造后的反轉錄酶，Cas9切口酶和pegRNA。pegRNA的5’端為sgRNA結構，3’端為一段與切開的DNA的3’端相結合的序列（PBS），在sgRNA和PBS之間是逆轉錄模板，包含目的DNA改變和一段與靶點同源的序列。一旦結合到靶點處，Cas9切口酶在包含PAM序列的DNA單鏈上形成切口，PE使DNA從斷端的3’端開始以pegRNA中的逆轉錄模板為模板進行逆轉錄，逆轉錄結束后，新合成的編輯后的DNA作為3’游離端與DNA切開后未編輯的5’游離端形成競爭關系，而細胞的修復機制會傾向于切除5’游離端，使編輯后的3’端與未編輯的對側鏈形成異源DNA雙鏈。DNA修復機制若以編輯后的DNA鏈為模板將未編輯鏈進行修復，最終就能實現DNA編輯。而在PE2的基礎上增加一個靶向未編輯鏈的sgRNA，與PE2已有的Cas9切口酶一起可以在未編輯鏈上做一個切口，但這個切口相距第一個切口需要一定的距離以避免產生雙鏈斷裂，能促使DNA的修復機制偏向于以編輯后的DNA鏈為模板進行修復，提高DNA編輯的效率，這個系統被命名為PE3。通過對逆轉錄模板的設計，來實現堿基替換、堿基插入和缺失。隨后，Nelson等[20]發現pegRNA 3’端的降解會降低PE的編輯效率，在3’端增加一段結構RNA序列可以增強pegRNA的穩定性，并將其命名為epegRNA。在細胞內，epegRNA能使PE的編輯效率提高3～4倍。Chen等[21]發現，在PE對DNA進行編輯的過程中，DNA錯配修復（MMR）會阻礙PE的編輯，并且導致indels的出現。他們分別在PE2和PE3的基礎上短暫表達MMR抑制蛋白，得到PE4和PE5，使得編輯效率分別提高了7.7倍和2.0倍，同時在MMR較強的細胞中將目的編輯/indels比例提高了3.4倍。另外，他們優化了PE2蛋白，包括使用人源密碼子優化的反轉錄酶、優化的核定位序列以及包含R221K和N394K變異的SpCas9，得到的結構命名為PEmax。PEmax在HeLa細胞中能使編輯效率平均提高2.8倍。
3 CRISPR相關技術用于IRD治療的不同策略
針對IRD不同的遺傳類型和致病機制，可以采用不同的基因編輯手段來達到治療疾病的目的。隱性遺傳的疾病若不適宜采用基因替代療法治療，如致病基因過大不易包裝[22]、過量表達會產生毒性等，就可以通過基因編輯來治療。一旦精準修復基因使得部分野生型蛋白能夠表達發揮其生理作用，就能部分恢復視功能[23]。而當致病變異位于非編碼區時，比如CEP290的內含子變異（c.2991+1655A>G（IVS26）（p.Cys998X）會導致CEP290蛋白表達減少，也可通過破壞變異位點來發揮治療作用[24]。
對于顯性致病變異所致的IRD，采用的策略可分為三種：（1）將等位基因破壞后，配合野生型基因的補充治療；（2）特異破壞變異基因，配合或不配合野生型基因的補充治療；（3）精準修復變異基因。
破壞雙等位基因后進行基因補充治療可以說是最直接的方式。基因破壞可通過CRISPR的NHEJ機制實現，這是一種非精確的基因編輯方式，可在DNA雙鏈斷裂處產生indels，通常會造成移碼突變，使得蛋白表達降低，或者穩定性下降[25]。也可以針對一段序列設計兩個sgRNA，實現對兩個sgRNA中間序列的刪除，相比一個sgRNA，不僅編輯效率更高，而且編輯產物更加可控[26-27]。在雙等位基因同時被破壞后，突變蛋白和野生型蛋白的表達都會降低，同時補充外源的野生型基因可以改善疾病表型[27]。
特異破壞變異基因需要CRISPR系統對變異基因序列有較高的特異性。變異基因需具有不存在于野生型基因中的獨特的PAM序列，或者sgRNA序列。變異基因中存在獨特的PAM序列雖然可高效地分辨變異序列和野生型序列[28]，但變異恰好位于PAM序列的情況較少。變異基因存在獨特sgRNA的情況稍常見，不過SpCas9區別僅有單個堿基不同的前序序列的效率不高，有報道可以通過截短的sgRNA來提高識別效率，如Li等[29]在RHOP23H小鼠模型中使用SpCas9-VRQR和截短的只有17 nt的sgRNA特異靶向變異序列，編輯效率達到（44.8±4.8）%，同時對野生型序列僅有（1.3±0.3）%的編輯效率。
精準修復基因變異可以通過CRISPR的HDR機制，但是HDR的效率比NHEJ低，且通常僅在有絲分裂的細胞中活性較高。而光感受器和RPE都是分化終期的細胞，HDR的效率極低，如Jo等[30]對RPE65基因點突變的rd12小鼠通過HDR機制修復點突變，最終在RPE細胞中修復的效率僅為1.17%，而由于同時存在的NHEJ使得indels的發生率高達20%。Suzuki等[31]提出一種可以不依賴HDR機制的定點整合，可以通過NHEJ機制實現DNA序列的整合，使得MERTK基因在mRNA水平上恢復到正常的4.5%，高于HDR的效率。而BE本身就是作為一種精準修復堿基的工具被提出，可以進行四種堿基顛換，在人和小鼠細胞系中可以達到約15%～75%的修復效率[15]。通過AAV系統遞送到野生型小鼠視網膜下腔，CBE對視桿細胞中單堿基的修復效率為19%，ABE的效率為26%[32]。同時發現ABE幾乎不產生indels，而CBE會產生高達34%的indels。Suh等[33]使用慢病毒遞送ABE至rd12小鼠模型，對RPE細胞中點突變的精準修復效率為16%，僅發生約0.5%的indels，但同時還存在編輯窗口內非靶位點的編輯。在6個最常見的長編碼區（超過單AAV的包裝限制）的隱性致病基因中，包括ABCA4、CDH23、CEP290、EYS、MYO7A、USH2A，對患者的致病變異位點進行分析發現，其中53%的致病變異可以通過BE進行編輯，76%的患者中至少存在一條可以被BE修復的等位基因[22]。PE是另一種可進行基因精準修復的工具，除了能實現所有類型的堿基互換，還能針對小片段插入或者缺失致病的疾病，幾乎覆蓋了大部分的變異類型。Jang等[34]采用視網膜下注射雙AAV遞送PE2系統至rd12小鼠，對RPE中點突變的精準修復效率為6.4%，同時未檢測到其他包括indels在內的非目標編輯，證實了PE系統的安全性。跟CRISPR的機制相比，PE2效率更高；跟ABE相比，PE造成的非靶向編輯更少，更加安全。
在以上三種策略中，特異針對變異位點策略，包括特異破壞變異基因或精準修復變異基因，都需要根據不同的變異位點進行專門的設計，使得這種方式更加個體化。而無差別破壞變異和野生型基因后導入外源性野生型基因，則不需要根據變異位點進行專門的設計，可以更廣泛地適用于某個基因變異的情況。
除了直接對致病基因進行修復外，CRISPR/Cas9還用于編輯其他相關基因，比如NRL、NR2E3基因。在典型的視網膜色素變性（RP）患者中，首先出現由于視桿細胞丟失導致的夜盲，視錐細胞繼發性死亡隨之發生，導致視力的惡化最終失明。因此在RP的治療中，視錐細胞功能的保留是主要目標。NRL、NR2E3基因在視桿細胞的發育和維持中起關鍵作用[35-36]。Yu等[25]在三種視桿細胞特異的基因變異導致的視網膜萎縮小鼠模型中，采用AAV遞送的CRISPR/Cas系統敲除視桿細胞的NRL基因，能使視桿細胞視錐化，有助于光感受器細胞的存活和視錐細胞功能的保存。Zhu等[37]則采用CRISPR/Cas系統同時敲除小鼠的NRL和NR2E3基因，實現更顯著的光感受器細胞的保存和視功能的重建。
4 CRISPR/Cas9及其相關技術在IRD治療的體內應用進展
4.1 RP
RP是一種以進行性視網膜萎縮為特點的疾病，是最主要的致盲性遺傳性眼病，發病率約為1/4 000[38]。到目前為止有約70個致病基因被發現，遺傳方式包括常染色體顯性遺傳（15%～25%）、常染色體隱性遺傳（5%～20%）、X-連鎖遺傳（5%～15%）和未知遺傳方式（40%～50%）[39]。
RHO基因變異占到常染色體顯性遺傳RP的20%～30%，到目前為止約有220多種變異被報道[40]。Latella等[26]在體外和小鼠體內驗證了SpCas9與單、雙sgRNA對RHO基因的敲除效率。其發現，在敲入RHOP23H變異基因的Hela細胞中，單sgRNA對基因的敲除效率為70%～76%，雙sgRNA的效率較高為82%。隨后，該團隊對人源RHOP23H基因敲入的RHO-/-小鼠（RHO-/-P23HTg）進行視網膜下注射Cas9、雙sgRNA和綠色熒光蛋白（GFP）質粒，隨后電轉，在GFP陽性細胞中RHOP23H基因的敲除率為4%～33%。Tsai等[27]則采用基因敲除與基因替代療法相結合的策略，在使用雙sgRNA敲除變異的RHO基因同時補充外源RHO基因。該策略在野生型小鼠中使RHO mRNA水平下降了25%，在RHOP23H或RHOD190N人源變異敲入小鼠模型中能夠明顯改善視網膜外核層厚度、光感受器細胞外節長度以及視網膜電圖反應。Editas公司也采用此策略來治療RHO變異導致的常染色體顯性RP。
也有特異針對RHO變異基因進行敲除的研究，Bakondi等[28]在RHOS334變異的大鼠模型中，根據僅存在于變異等位基因中的PAM序列設計了特異針對變異基因的sgRNA，對變異基因的敲除比例為33%～36%，而對野生型基因沒有影響，減緩了光感受器的退化，改善了大鼠視力。導致常染色體顯性RP最常見的變異是RHO p.Pro23His，Burnight等[41]首先在患者來源的存在RHOP23H變異的誘導多能干細胞（iPSC）中驗證了SaCas9和20 nt或17 nt的sgRNA對變異序列的編輯效率是對僅存一個堿基差異的野生型序列的19倍或22倍，隨后在RHOP23H人源化豬模型中檢測AAV遞送SaCas9以及17 nt的sgRNA的基因編輯效率，2/5只治療后的豬視網膜檢測到3.4%～4.4%的NHEJ的發生。Li等[29]和Giannelli等[42]在RHOP23H人源化小鼠模型中驗證了特異sgRNA對變異基因的靶向性，使用截短的sgRNA或SpCas9變體可以提高對變異基因的靶向性，在對野生型基因沒有或者僅有很低indels產生的情況下，特異敲除P23H變異基因，顯著減緩了光感受器的凋亡和挽救視網膜功能。
NR2E3表達一種光感受器特異性轉錄因子，目前發現的NR2E3與常染色體顯性RP相關的變異只有p.Gly56Arg變異，并且此變異是導致常染色體顯性RP第二常見的變異[43]。Diakatou等[44]針對變異的序列設計的sgRNA能特異性靶向變異的等位基因，將sgRNA和Cas9遞送至存在NR2E3 p. Gly56Arg變異的患者來源的iPSC中，在變異位點附近實現了一個或兩個堿基的插入或缺失，實現了變異的等位基因的特異敲除。
4.2 Usher綜合征
Usher綜合征是一種常染色體隱性遺傳的以感音神經性耳聾和RP為特點的疾病。USH2A是其最常見的致病基因，但是由于其編碼區有近15 kb，使用基因替代療法會有一些困難，同時在視網膜中存在多個USH2A基因編碼的異構體的表達，僅遞送單種異構體可能不夠。而基于CRISPR/Cas9技術的基因編輯技術則能直接對變異的基因進行修復。Fuster-García等[45]采用sgRNA、Cas9和ssODN在帶有USH2A c.2299delG或c2276G>T純合變異的患者的皮膚成纖維細胞中分別達到了5.0%或2.5%的精準編輯的效率。在Usher綜合征第三型中，常見的致病基因是CLRN1，Panagiotopoulos等[46]在沙特阿拉伯人群中新發現了CLRN1基因的內含子變異（c.254-649T>G），這個剪接位點變異會導致一個新的外顯子的出現，因此他們在變異的兩側分別設計了sgRNA，在人RPE細胞系中證實敲除的比例約30%。
4.3 Leber先天性黑矇（LCA）
LCA是最嚴重的遺傳性視網膜疾病之一，其發病時間早，且患者視力損害嚴重。全球發病率約為1/30 000，占所有IRD的5%[47-48]。LCA具有高度遺傳異質性，到目前為止有28個致病基因，超過400種致病變異，大多數為常染色體隱性遺傳[49]。其中，最常見的致病基因包括AIPL1、CEP290、RDH12、GUCY2D、CRB1、RPE65和RPGRIP1[49]。
CEP290變異（LCA10型）占到了所有LCA的15%～20%，是常染色體隱性變異，在歐洲和美國，內含子變異c.2991+1655A＞G（p.Cys998X）是其中的主要致病變異類型，又稱IVS26變異，占55%～77%[50]。此變異可產生新的剪接供體位點，會在約一半的轉錄本中導致引入一段新的外顯子，而這段外顯子中存在提前出現的終止密碼子，使得CEP290蛋白截短，這使存在IVS26變異的患者體內僅部分CEP290有活性。Ruan等[23]首先在構建的存在CEP290 IVS26剪接變異的293FT模型細胞中驗證SpCas9和雙sgRNA可實現對包含變異位點的內含子片段的刪除，增加全長CEP290蛋白的表達；隨后由于疾病動物模型的缺乏，在野生型小鼠中采用雙AAV系統同時遞送SpCas9和雙sgRNA，視網膜下注射后4周檢測視網膜基因組中截短DNA的比例達到7.5%～26.4%。Ledford[51]采用比SpCas9更小的SaCas9與成對sgRNA包裝到單AAV中，首先在體外，包括LCA10型患者的成纖維細胞和人捐獻視網膜植片，篩選并驗證sgRNA位點；隨后在敲入人CEP290 IVS26變異的小鼠模型以及野生型獼猴中證實有效基因編輯效率分別可達21%和28%[24]。這款產品被名命為Edit-101，并于2018年底獲美國食品和藥品管理局批準進行臨床試驗（NCT03872479），并于2020年宣布完成了第一例患者給藥，這是全球首項體內基因編輯CRISPR臨床試驗。
RPE65基因變異（LCA2型）雖然已經有基因替代治療的藥物上市，但是對于接受治療的患者的長期隨訪結果顯示，基因替代治療藥物并不能延緩患者視網膜萎縮的進程，并且對于視功能的改善作用呈現一個上升后下降的趨勢[52-53]。這些結果促使學界仍在做進一步的研究。rd12小鼠是RPE65基因自發點突變產生的LCA 2型的動物模型，Jo等[30]利用HDR對rd12小鼠的變異基因進行修復，雖然在RPE細胞中修復的效率較低為1.17%，但治療小鼠的視網膜功能仍能部分恢復。而用ABE對rd12小鼠進行基因修復，在RPE細胞中對致病變異的修復效率為16%，恢復了部分RPE65蛋白的表達，保存了視錐細胞，使治療小鼠存在近乎正常的視功能[33, 54]。
4.4 錐桿細胞營養不良（CORD）
GUCY2D基因編碼蛋白retGC1，其致病變異在常染色體顯性CORD患者中占到35%[55]。McCullough等[56]分別針對小鼠和獼猴的基因進行sgRNA設計，通過視網膜下注射AAV5遞送SaCas9和sgRNA，基因編輯效率在小鼠體內高到81%，在獼猴體內達到10%～20%，并且顯著降低retGC1蛋白的表達，證實了可能通過對GUCY2D敲除并補充外源性野生型蛋白來實現對GUCY2D常染色體顯性致病變異導致的CORD進行治療。
5 CRISPR/Cas9及其相關技術的安全性
CRISPR/Cas9及其相關技術目前最令人擔憂的安全性問題是其脫靶效應。脫靶會造成非預期的基因產生替換、缺失、插入、顛倒和易位等變異，進而造成遠期的生物學影響[57]，是制約其臨床應用的關鍵問題。CRISPR/Cas9的特異性取決于sgRNA靶向序列的特異性與Cas9本身的保真度。研究者通過提高sgRNA設計的特異性、工程化改造Cas9蛋白等方法來降低CRISPR/Cas9的脫靶效應[58]。人們發現CBE會引起大量全基因組的脫靶，CBE和ABE會引起RNA水平的脫靶[59-60]。這些脫靶效應與sgRNA無關，主要是由脫氨酶引起，需要通過優化脫氨酶以降低脫靶效應。與CRISPR/Cas9和BE相比，PE引起的脫靶效應更低[16, 61]。然而，目前人們對脫靶效應的認識很大程度上依賴于現有的脫靶檢測方法[58]。
6 小結
目前已有很多研究利用CRISPR/Cas9對致病基因進行了糾正并能改善疾病表現，但技術還在不斷的發展以提高基因編輯的效率，減少脫靶效應以提高其安全性。另外大部分的基因編輯工具超過了AAV的載量，研究者們還在致力于探索新的高效的遞送方法或遞送工具，例如用雙AAV遞送或者載量更大的慢病毒。CRISPR/Cas9及其相關技術由于其應用的便捷，正在被大量研究，各種技術瓶頸也在逐漸被突破，對于IRD這種目前沒有有效治療方法的疾病而言，CRISPR/Cas9及其相關技術是一項極具前景的治療手段。